Cambios en el control transcripcional y en la actividad proteolítica de Lonp1 en el envejecimiento : Contribución a la disfunción mitocondrial en el hipocampo por la acumulación de Tau PHF-1

Abstract

El envejecimiento se caracteriza por el deterioro de las funciones cerebrales, y en el hipocampo esto se asocia con la pérdida de memoria a avanzada edad. Dentro de los mecanismos que subyacen al deterioro cognitivo se encuentran los cambios epigenéticos, la disfunción mitocondrial y la acumulación de proteínas anómalas. La mitocondria posee proteasas de la superfamilia AAA+ como Lonp1, una serina peptidasa que mantiene el proteoma mitocondrial. Lonp1 es codificada por el gen nuclear Lonp1 y este gen experimenta cambios de metilación en condiciones patológicas y ambientales, sugiriendo que el gen de Lonp1 es regulado epigenéticamente, aunque no se conoce qué lector epigenético podría regular su expresión. Mecp2 es el lector epigenético más expresado en cerebro y que regula la expresión de genes nucleares que codifican para proteínas mitocondriales. Se ha propuesto a la mitocondria como una ruta complementaria a la degradación de proteínas citoplasmáticas, sustratos del proteasoma, donde Lonp1 es clave. Lonp1 degrada proteínas citoplasmática como βcatenina y TDP-43, sugiriendo que otras proteínas anómalas son degradadas por Lonp1, como la proteína Tau fosforilada. Tau regula la dinámica de los microtúbulos mediante su estado de fosforilación. Sin embargo, cuando Tau se fosforila en residuos específicos incluyendo la Serina 396 y Serina 404 (epítope Tau PHF-1) esta se disocia de los microtúbulos, se acumula en el citoplasma y eventualmente forma agregados en un grupo de patologías conocidas como taupatías. Interesantemente, la sobreexpresión de una forma pseudofosforilada de Tau PHF-1 induce disfunción mitocondrial in vitro. Por el contrario, la deleción de Tau mejora la función mitocondrial y las capacidades cognitivas en animales envejecidos. Tau se degrada principalmente por el proteasoma, y reportes de nuestro laboratorio muestran que Tau PHF-1 se acumula en las mitocondrias del hipocampo de ratones envejecidos y se correlaciona con disfunción mitocondrial; lo que sugiere a Tau PHF-1 como un candidato de degradación mitocondrial mediada por Lonp1, que podría acumularse debido a deficiencias en la actividad de esta proteasa, induciendo la disfunción mitocondrial. En base a estos antecedentes, propusimos la siguiente hipótesis: Cambios en el control transcripcional de Lonp1 mediados por Mecp2 y en la actividad de esta proteasa en el hipocampo de ratones SAMP8 envejecidos contribuyen a la disfunción mitocondrial inducida por la acumulación de Tau PHF-1 en 8 este organelo . Para probar esta hipótesis propusimos dos objetivos específicos: 1) Evaluar cambios en el control transcripcional de Lonp1 mediados por Mecp2 y en su actividad proteolítica en el hipocampo de ratones SAMR1 y SAMP8 adultos y envejecidos; y 2) Determinar la disminución de la actividad proteolítica de Lonp1 aumenta los niveles de Tau PHF-1 en la mitocondria, causando la disfunción mitocondrial en el hipocampo de ratones SAM no envejecidos. Para responder a estos objetivos, realizamos predicciones bioinformáticas de islas CpG y corroboramos los cambios de metilación del gen Lonp1 por MSP-PCR; evaluamos la unión de Mecp2 al promotor de Lonp1 por ChIP-Mecp2, medimos los niveles proteicos y de fosforilación de Mecp2 (lo que regulan su unión/disociación a los promotores de sus genes blanco); determinamos los niveles de ARNm de Lonp1 por RT-qPCR y la actividad proteolítica de Lonp1 por el kit FITC-Caseína. Además, evaluamos los niveles de Tau PHF-1 por Western blot; realizamos tratamientos ex-vivo inhibiendo la actividad proteolítica de Lonp1 para determinar si esto promueve la acumulación de Tau PHF-1, y si esta acumulación induce disfunción mitocondrial; finalmente realizamos ensayos de degradación in vitro para evaluar si Tau PHF-1 es sustrato de Lonp1. Los resultados indican que aumenta la metilación del promotor de Lonp1 en el envejecimiento, que Lonp1 es gen blanco de Mecp2, y que en el envejecimiento hay menor unión de Mecp2 al promotor de Lonp1, posiblemente como consecuencia de los reducidos niveles de Mecp2 y de su fosforilación en Serina 80, lo que reduciría la unión de Mecp2 a sus genes blanco. Por otra parte, los niveles de mRNA de Lonp1 aumentan en el hipocampo envejecido, sugiriendo que Mecp2 podría actuar como un represor transcripcional de Lonp1; pero, sorpresivamente, los niveles proteicos de Lonp1 se reducen, de igual manera que su actividad proteolítica, por lo que a pesar de la regulación transcripcional inducida por Mecp2, probablemente existen otros mecanismos post-traduccionales y de degradación, aun desconocidos, que controlan la expresión proteica de Lonp1 y su actividad degradativa en el envejecimiento. Finalmente, la inhibición de Lonp1 promueve la acumulación de Tau PHF-1, ya que Tau PHF-1 es sustrato de Lonp1, y la acumulación de Tau PHF-1 induce disfunción mitocondrial. Así, concluimos que Mecp2 regula transcripcionalmente a Lonp1, que la pérdida de función de Lonp1 induce la acumulación de Tau PHF-1 y consecuentemente esto induce disfunción mitocondrial en el hipocampo de ratones SAMP8 envejecidos.

Aging is characterized by deterioration of brain functions, and in the hippocampus, this is associated with memory loss in older age. The mechanisms underlying cognitive decline include epigenetic changes, mitochondrial dysfunction, and the accumulation of abnormal proteins. Mitochondria possess AAA+ superfamily proteases such as Lonp1, a serine peptidase that maintains the mitochondrial proteome. Lonp1 is encoded by the nuclear gene Lonp1, and this gene undergoes methylation changes under pathological and environmental conditions, suggesting that the Lonp1 gene is epigenetically regulated, although it is not known which epigenetic reader might regulate its expression. Mecp2 is the most expressed epigenetic reader in the brain and regulates the expression of nuclear genes encoding mitochondrial proteins. Mitochondria have been proposed as a complementary pathway for the degradation of cytoplasmic proteins, substrates of the proteasome, where Lonp1 is key. Lonp1 degrades cytoplasmic proteins such as β-catenin and TDP-43, suggesting that other abnormal proteins are degraded by Lonp1, such as phosphorylated Tau protein. Tau regulates microtubule dynamics through its phosphorylation state. However, when Tau is phosphorylated at specific residues, including at Serine 396 and Serine 404 (Tau epitope PHF-1), it dissociates from microtubules, accumulates in the cytoplasm, and eventually forms aggregates in a group of pathologies known as tauopathies. Interestingly, overexpression of a pseudophosphorylated form of Tau PHF-1 induces mitochondrial dysfunction in vitro. In contrast, Tau deletion improves mitochondrial function and cognitive abilities in aged animals. The proteasome mainly degrades Tau and reports from our laboratory show that Tau PHF-1 accumulates in hippocampal mitochondria of aged mice and that this correlates with mitochondrial dysfunction, suggesting Tau PHF-1 as a candidate for Lonp1-mediated mitochondrial degradation, which could accumulate due to deficiencies in the activity of this protease, ultimately inducing mitochondrial dysfunction. Based on this information, we proposed the following hypothesis: Changes in the transcriptional control of Lonp1 mediated by Mecp2 and in the activity of this protease in the hippocampus of aged SAMP8 mice contribute to mitochondrial dysfunction induced by the accumulation of Tau PHF-1 in this 10 organelle . To test this hypothesis we proposed two specific objectives: 1) To evaluate changes in the transcriptional control of Lonp1 mediated by Mecp2 and its proteolytic activity in the hippocampus of adult and aged SAMR1 and SAMP8 mice; and 2) To determine whether decreased Lonp1 proteolytic activity increases Tau PHF-1 levels in mitochondria, causing mitochondrial dysfunction in the hippocampus of non-aged SAM mice. To address these objectives, we performed bioinformatic predictions of CpG islands and corroborated Lonp1 gene methylation changes by MSP-PCR; we assessed the binding of Mecp2 to the Lonp1 gene promoter by ChIPMecp2, measured the protein and phosphorylation levels of Mecp2 (which regulate its binding/dissociation to the promoters of its target genes); determined Lonp1 mRNA levels by RT-qPCR and Lonp1 proteolytic activity by the FITC-Casein kit. In addition, we assessed Tau PHF-1 levels by Western blot; we performed ex-vivo treatments inhibiting Lonp1 proteolytic activity to determine whether this promotes Tau PHF-1 accumulation and whether this accumulation induces mitochondrial dysfunction; finally, we performed in vitro degradation assays to assess whether Tau PHF-1 is a substrate of Lonp1. The results indicate that Lonp1 promoter methylation increases in aging, that Lonp1 is a target gene of Mecp2, and that in aging there is less binding of Mecp2 to the Lonp1 promoter, possibly as a consequence of the reduced levels of Mecp2 and its phosphorylation at Serine 80, which would reduce the binding of Mecp2 to its target genes. On the other hand, Lonp1 mRNA levels are increased in the aged hippocampus, suggesting that Mecp2 may act as a transcriptional repressor of Lonp1; but, surprisingly, Lonp1 protein levels are reduced, as is its proteolytic activity, so that despite Mecp2-induced transcriptional regulation, there are probably other, as yet unknown, post-translational and degradation mechanisms that control Lonp1 protein expression and its degradative activity in aging. Finally, Lonp1 inhibition promotes Tau PHF-1 accumulation since Tau PHF-1 is a substrate of Lonp1, and Tau PHF-1 accumulation induces mitochondrial dysfunction. Thus, we conclude that Mecp2 transcriptionally regulates Lonp1, that loss of Lonp1 function induces Tau PHF-1 accumulation, and consequently, this induces mitochondrial dysfunction in the hippocampus of aged SAMP8 mice.