Mecanismo de gating del hemicanal de conexina 26 humana mediado por el cambio conformacional del dominio N-terminal

Abstract

Las conexinas (Cxs) son proteínas de membrana que forman hemicanales (HCs) y gap junction channels (GJCs), esenciales en procesos como la contracción cardíaca, la sinapsis eléctrica y la comunicación celular. Estos canales se regulan mediante un mecanismo de apertura y cierre (gating) sensible al voltaje, al pH y al Ca2+ extracelular. Un elemento clave en este proceso es la hélice Nterminal (NTH), localizada en el poro, cuya conformación en el estado abierto continúa siendo motivo de debate. La estructura cristalográfica de hCx26 (2009) y los modelos posteriores de cryo-EM de sCx46/Cx50 y hCx26 (2018, 2020) muestran orientaciones diferentes de la NTH, lo que mantiene abierta la discusión sobre cuál de estas conformaciones corresponde al estado abierto. Para abordar esta cuestión, se construyó un modelo híbrido del HC de hCx26 con la orientación de la NTH observada en sCx50 y se comparó con el modelo cristalográfico de 2009 mediante simulaciones de dinámica molecular (MD) y muestreos tipo umbrella sampling para luego calcular el PMF que describa la transición entre ambas conformaciones. El modelo híbrido mostró mayor estabilidad en equilibrio, aunque el perfil de energía libre (PMF) indicó que ambas conformaciones son igualmente probables, con barreras menores al ruido térmico. Estos resultados sugieren que la NTH puede adoptar más de una conformación en el estado abierto. Mientras en 2020, las nuevas estructuras resueltas por cryo-EM del GJC de hCx26 a pH ´acido y del HC de hCx31.3, donde las NTHs podrían cerrar el canal siguiendo modelos de gating de “bolacadena” y de “compuerta” respectivamente. Entonces, se exploraron los cambios conformacionales en el mecanismos de gating de “compuerta”. Donde se evaluó la estabilidad termodinámica de los estados abierto, semicerrado y cerrado mediante modelamiento comparativo, usando como molde la estructura del HC de hCx31.3 y aplicando restricciones de distancia, y simulaciones de metadinámica. Aunque se observaron diferencias energéticas que favorecen el estado abierto con respecto al estado semicerrado, las transiciones hacia el estado cerrado no pudieron caracterizarse de manera concluyente y el modelo del estado cerrado tendió a reabrirse en equilibrio, lo que indica la necesidad de modificaciones al modelo de “compuerta” incorporando evidencia estructural más reciente, como la obtenida del GJC Cx43. En contraste, se evaluó el modelo de “bola-cadena” mediante una simulación al equilibrio que mostró estabilidad dinámica y un estrechamiento del poro hasta ∼5 ˚A, constituyéndose como un candidato plausible para describir el cierre completo del HC, aunque requiere mayor validación experimental in silico. En conclusión, los resultados apoyan que: (i) la NTH en el estado abierto puede adoptar tanto la conformación observada en el modelo cristalográfico del HC de hCx26 como la descrita en sCx46/Cx50 y en hCx26 resueltas por cryo-EM; (ii) el modelo de “compuerta” necesita ser refinado incorporando nueva evidencia estructural para representar adecuadamente el cierre; (iii) el modelo de “bola-cadena” es consistente con un estado cerrado estable, pero aún debe ser respaldado con estudios adicionales. Finalmente, esta tesis doctoral contribuye en la comprensión de la dinámica estructural de los canales formados por de conexinas.

Connexins (Cxs) are membrane proteins that form hemichannels (HCs) and gap junction channels (GJCs), which are essential for processes such as cardiac contraction, electrical synapses, and cell–cell communication. These channels are regulated by a gating mechanism that is sensitive to voltage, pH, and extracellular Ca2+. A key element in this process is the N-terminal helix (NTH), located in the pore, whose conformation in the open state remains a subject of debate. The crystallographic structure of hCx26 (2009) and subsequent cryo-EM models of sCx46/Cx50 and hCx26 (2018, 2020) show different NTH orientations, keeping the discussion open about which of these conformations corresponds to the open state. To address this question, a hybrid model of the hCx26 HC was constructed with the NTH orientation observed in sCx50 and compared with the 2009 crystallographic model using molecular dynamics (MD) simulations and umbrella sampling to then calculate the potential of mean force (PMF) describing the transition between both conformations. The hybrid model showed greater equilibrium stability, although the free energy profile (PMF) indicated that both conformations are equally probable, with barriers smaller than thermal noise. These results suggest that the NTH can adopt more than one conformation in the open state. In 2020, newly resolved cryo-EM structures of the hCx26 GJC at acidic pH and the hCx31.3 HC suggested that NTHs could close the channel following “ball-and-chain” and “gate” gating models, respectively. Consequently, conformational changes in the “gate” mechanism were explored, where the thermodynamic stability of the open, semi-closed, and closed states was evaluated using comparative modeling based on the hCx31.3 HC structure as a template, applying distance restraints, and performing metadynamics simulations. Although energetic differences favoring the open state over the semi-closed state were observed, the transitions to the closed state could not be conclusively characterized, and the closed-state model tended to reopen at equilibrium, indicating the need to refine the “gate” model by incorporating more recent structural evidence, such as that obtained from the Cx43 GJC. In contrast, the “ball-and-chain” model was evaluated through an equilibrium simulation, which showed dynamic stability and pore narrowing down to ∼5 ˚A, making it a plausible candidate for describing full HC closure, although it requires further experimental and in silico validation. In conclusion, the results support that: (i) the NTH in the open state can adopt either the conformation observed in the hCx26 HC crystallographic model or that described in sCx46/Cx50 and hCx26 resolved by cryo-EM; (ii) the “gate” model needs refinement by incorporating new structural evidence to adequately represent closure; and (iii) the “ball-and-chain” model is consistent with a stable closed state but still requires additional supporting studies. Altogether, this doctoral thesis contributes to the understanding of the structural dynamics of connexin-formed channels.